La novela se centra en el choque entre la barbarie rural y la civilización urbana, la superstición y la racionalidad, y la tradición y el progreso. Se desarrolla en los llanos venezolanos, donde los terratenientes se disputan la propiedad de las haciendas. Los protagonistas, Santos Luzardo y Doña Bárbara tienen una pelea por la posesión de las tierras que ambos reclaman. La narración pone de manifiesto la anarquía de los llanos, fomentada por la barbarie o el salvajismo rural de la región.
El relato comienza con la llegada de Santos a la hacienda de Altamira para vender su mitad de las tierras. Sin embargo, se encuentra con que Doña Bárbara le ha quitado la otra mitad a su amante Lorenzo Barqueros y reclama el resto del rancho. Debido a los malos tratos recibidos de los hombres, Bárbara se venga de todos los hombres, incluidos sus socios. Deja a Lorenzo sin la propiedad de la tierra, lo que hace que su hija también se quede sin hogar.
Bárbara es temida en la región por su crueldad, pero Santos se embarca en una cruzada para reclamar su parte del rancho. Santos quiere refinar y vender el pedazo de tierra, pero Bárbara quiere que el ganado corra salvaje sin vallas. Su disputa se intensifica con el tiempo, ya que Bárbara ejerce la violencia a través de sus secuaces, lo que pone de manifiesto la barbarie. La rivalidad representa el abismo entre la sociedad civilizada y el salvajismo que existe en la sociedad venezolana.
La batalla entre los dos herederos da un giro cuando Doña Bárbara se enamora de Santos. Mientras tanto, su hija Marisela también mantiene una relación sentimental con Santos que obliga a Bárbara a reconsiderar sus sentimientos. Ella opta por dejar la propiedad de las tierras a su hija y devuelve la parte del rancho que le quitó a Santos. La disputa termina cuando Bárbara se va para siempre y los ranchos se unen en armonía. En la narración, Gallegos demuestra la anarquía y la barbarie imperantes en la región tras su independencia de la colonización española. Santos Luzardo representa los aspectos de la civilización y el derecho que pretenden actualizar y refinar la cultura en los llanos.
