Orlando
Es el personaje protagonista de la novela. Al comienzo, Orlando es un joven de dieciséis años, descendiente de nobles. Vive en el siglo XVI y encuentra placer en escribir poesía y vivir aventuras.
En la mitad del relato, luego de un letargo de siete días, Orlando se transforma en una mujer. Esto le permite conocer cómo se experimenta el mundo perteneciendo tanto a un género como a otro. Lo que conserva durante toda su vida es el amor por la naturaleza y la literatura. Al final del último capítulo, Orlando es una mujer de 36 años a comienzos del siglo XX.
Marmaduke Bonthrop Shelmerdine
Tanto el narrador como Orlando refieren a él como "Shel". Es el hombre del que se enamora Orlando en el capítulo quinto, y quien se convierte en marido de esta. Es marino. Luego de que Shel se entera de que Orlando era un hombre, él confiesa ser en verdad mujer. Pasan un tiempo juntos, hasta que el viento cambia y Shel vuelve a navegar. De la misma manera que otros personajes de la novela, Shel se debate entre el amor por Orlando y el amor por el mar.
La Condesa de R.
Mujer de la alta sociedad londinense del siglo XVIII, conocida por organizar grandes fiestas. Orlando asiste a varias de estas y es allí donde conoce a Pope y a otros escritores de influencia.
Nell
Es una prostituta con la que Orlando se acuesta en el cuarto capítulo, cuando ya es mujer pero viste de hombre. Luego, la protagonista le confiesa a Nell su verdadero sexo, y esta entonces se relaja, le cuenta historias y se la presenta a todas sus amigas.
Alexander Pope
Este personaje alude al escritor británico Alexander Pope, uno de los más célebres del siglo XVIII. En la novela, Orlando venera a Pope hasta que lo conoce personalmente y descubre que la mayor parte del tiempo se comporta como un hombre grotesco, como cualquier otro.
Sasha
Es una princesa moscovita. Orlando la conoce durante la helada de invierno, en el primer capítulo. Entablan una relación que se rompe cuando Orlando le propone que huyan juntos, pero ella abandona el continente sin él. Orlando sentirá por Sasha un amor muy profundo que no se disolverá con el paso del tiempo.
Nicholas Green
Es un escritor admirado por Orlando, hasta que Nick demuestra ser lo contrario de lo que el protagonista espera de él. Cuando Orlando lo conoce, en la época isabelina, Green está amargado e insatisfecho con su situación, al mismo tiempo que considera que no hay grandes escritores en su tiempo y que todos los talentosos están muertos. Después de conocer a Orlando, Green escribe una parodia basada en él, lo que hace que Orlando abandone por un tiempo la poesía. En el siglo XX Orlando volverá a encontrar a Nick, y este demostrará haber ajustado sus apreciaciones en relación a su tiempo: ahora criticará a sus contemporáneos y venerará a los mismos escritores isabelinos a quienes antes defenestraba.
Euphrosyna
En el primer capítulo, es la mujer con quien Orlando se compromete cuando está en la corte, pero la relación entre ellos no funciona porque Orlando le es infiel con Sasha.
Isabel I
Orlando conoce a la reina Isabel I cuando es un niño, en el primer capítulo, y ella se fascina con él, al punto de que lo nombra mayordomo y tesorero, ofreciéndole así una posición privilegiada. Se insinúa que a la reina le gusta Orlando más que como un sirviente, y por eso se enoja cuando lo encuentra besando a una chica. La reina muere pocos años después de la llegada de Orlando a la corte; su sucesor es el rey Jaime I.
Carlos II
Aparece brevemente en el segundo capítulo, y envía a Orlando a Constantinopla como embajador.
Rosina Pepita
Es una bailarina con la que Orlando supuestamente se casó y tuvo hijos.
Pureza, Castidad y Modestia
Personificadas como extrañas señoras, se aparecen en el tercer capítulo, en la habitación de Orlando, en Constantinopla, durante la noche. Luego de esta visita, Orlando se despierta siendo mujer.
Capitán Nicolás Benedicto Bartulo
Es el capitán el barco que lleva a Orlando de Constantinopla a Inglaterra. Trata a Orlando con respeto y distancia porque es una mujer. Es la primera vez que Orlando siente las implicancias de su nuevo género.
Archiduquesa Harriet/ Archiduque Enrique
Harriet es una archiduquesa romana, prima de la reina, que intenta seducir a Orlando en el segundo capítulo. Ella es la razón por la que Orlando le pide al rey que lo envíe a Constantinopla. Cuando vuelve a Inglaterra, vuelve a encontrarse con Harriet pero se entera de que es en verdad un hombre llamado Enrique que intentaba acercarse a Orlando haciéndose pasar por mujer. Como Orlando es entonces una mujer, Enrique revela su verdadero género. Luego, le propone matrimonio a Orlando, pero esta no acepta.
Sukey
Muchacha de clase baja con quien Orlando vive algunas aventuras siendo un jovencito en el siglo XVI, hasta que se cansa y vuelve a la vida de noble.
Bartholomew
Ama de llaves de Orlando. En el quinto capítulo, Orlando le pide su anillo de bodas para verlo, pero esta se niega a dárselo.
