Matar un ruiseñor toma lugar en Maycomb, en el estado sureño de Alabama, durante la Gran Depresión de los 1920 y es narrada por el personaje principal, una pequeña de nombre Jean Louise “Scout” Finch. Su padre, Atticus Finch, es un abogado de grandes valores morales. A Scout, a su hermano Jem y a su amigo Dill les generan mucha intriga los rumores del pueblo sobre un hombre llamado Boo Radley, que vive en el vecindariovecindario, pero jamás abandona su hogar. La leyenda dice que una vez apuñaló a su padre en la pierna con una tijera, y se lo describe como casi un monstruo. Dill es de Mississippi pero pasa su verano en Maycomb, en una casa cerca de la de los Finch.
Los niños quieren averiguar más sobre Boo y, durante un verano, componen una pequeña obra teatral que narra los sucesos de su vida según lo que ellos escucharon, y en la que actúan. Lentamente, los niños comienzan a acercarse a la casa de Radley, que se dice está estar embrujada. Intentan dejarle notas a Boo en su ventana con una caña de pescar, pero Atticus los atrapa y los regaña firmemente por burlarse de la vida de un pobre hombre pobre. Luego, los niños intentarán escaparse de casa por la noche y espiar a través de su ventana. El hermano de Boo, Nathan Radley, quien que también vive en la casa, cree escuchar un merodeador y dispara su arma. Los niños escapan corriendo, pero los pantalones de Jem quedan atorados enganchados en una cerca. Cuando regresa en la mitad de la a la media noche para recuperarlos, los encuentra prolijamente doblados, y con la rotura producto hecha de por la cerca ya había sido cosida.
Otros acontecimientos misteriosos les ocurren a los niños Finch. Un árbol cerca de la casa de Radley tiene un agujero en el que suelen dejarles pequeños regalos, como monedas, goma de mascar y figuras de un niño y una niña hechas de jabón y muy parecidas a Scout y Jem. Los niños no saben de dónde provienen esos regalos y cuando le dejan una nota al misterioso dador, se encuentran con que el hermano de Boo tapó el agujero con cemento. El invierno siguiente traejo frío y nieve fuera de lo común, y la casa de la señorita Maudie se incendiainciende. Mientras Jem y Scout, temblando, observan las llamas desde las cercanías de la casa de los Radley, alguien arropa a Scout con una manta sin que ella lo note. Solo cuando regresa a casa y Atticus le pregunta de quién es la manta, ella cae en la cuenta de que Boo Radley debe haberla tapado mientras estaba absorta observando a la señorita Maudie, su vecina favorita, y su casa en llamas.
Atticus decide tomar el caso de un hombre negro llamado Tom Robinson, que fue acusado de violar a una joven blanca de origen muy pobre, Mayella Ewell. Ella era miembro de la famosa familia Ewell que pertenecía a la clase social de Maycomb a la que la gente se refería como “basura” (en el sentido de “basura blanca,” blancos “equivalantes” informalmente a negros en el sistema norteamericano de apartheid). La familia Finch enfrenta críticas fuertes críticas en el la ciudad extremadamente racista de Maycomb debido a la decisión de Atticus de defender a Tom. Sin embargo, Atticus insiste en continuar con el caso porque su conciencia no le dejaría hacer lo contrario. Sabe que Tom es inocente y también que casi no tiene chances de ser absuelto porque ningún jurado conformado por blancos le creería a un hombre afroamericano antes que a una mujer blanca. A pesar de esto, Atticus quiere revelarles la verdad a los habitantes de su pueblo, exponer su intolerancia y motivarlos a imaginar la posibilidad de la igualdad racial.
Como Atticus defiende a un hombre afroamericano, Scout y Jem se encuentran envueltos en rumores y burlas, y les cuesta mantenerse tranquilos. En una reunión familiar por para celebrar la Navidad, Scout le da una paliza a su molesto familiar Francis cuando este acusa a Atticus de arruinar el apellido familiar por ser un “amante de negros”. Jem arranca algunas flores de los arbustos de una vecina después de que esta ésta se burlara de Atticus, y, como castigo, debe tiene que leerle en voz alta todos los días. Jem no se da cuenta sino hasta después de que ella muriera muere que él la estaba ayudando a superar su adicción a la morfina. Cuando Atticus les cuenta esto a Jem y a Scout, él toma a esta mujer como un ejemplo de verdadera valentía: la voluntad de seguir luchando incluso cuando sabes que no puedes ganar.
El momento del juicio se acerca, y la hermana de Atticus, Alexandra, viene a quedarse con la familia. Ella es anticuada y formal, y quiere que Scout se ajuste al modelo del ideal femenino sureño, a pesar de la resistencia de Scout. Dill huye de su hogar, donde su padre y su madre parecen no preocuparse por él, y se queda en Maycomb durante el verano del juicio a Tom. La noche antes del juicio, Tom es trasladado a la prisión del condado, y Atticus, temiendo un posible linchamiento, hace guardia en la puerta de la prisión toda la noche. Jem está preocupado por él, y los tres niños se escapan al pueblo para buscarlo. Un grupo de hombres llegan listos para atacar a Tom y amenazan a Atticus en el proceso. Al principio, Jem, Scout y Dill no participan, pero cuando Scout siente que su padre está en peligro serio, corre y comienza a hablarle a uno de los hombres, que es el padre de uno de sus compañeros de escuela. Su inocencia hace que los hombres cambien de idea y estos se marchan.
El juicio enfrenta las pruebas de la familia Ewell, de raza blanca, contra las pruebas de Tom. Según los Ewells, Mayella le pidió a Tom que le hiciera algunas tareas mientras su padre no estaba, y Tom entró a su casa y la golpeó y la violó hasta que su padre apareció y lo espantó. La versión de Tom es que Mayella lo invitó a entrar, se abalanzó sobre él abrazándolo y comenzó a besarlo hasta que Tom intentó alejarla. Cuando Bob Ewell llegó, se encolerizó y la golpeó, mientras Tom huía asustado. Según el testimonio del sheriff, los moretones de Mayella estaban en el lado derecho de su rostro, lo que significa que probablemente fue golpeada por un zurdo. El brazo izquierdo de Tom Robinson cuelga casi enteramente inútil debido a un accidente que sufrió hace años, mientras que el señor Ewell firma su nombre con su mano izquierda. Dada la evidencia que está más allá de la duda razonable, Tom debería ser liberado; pero después de deliberar por horas, el jurado lo declara culpable. Scout, Jem y Dill se escabullen al tribunal para ver el juicio y se sientan en el balcón junto con la población afroamericana de Maycomb. No pueden creer el veredicto porque, para ellos, las pruebas beneficiaban claramente a Tom.
A pesar del veredicto desafortunado, Atticus siente que el jurado tardó mucho tiempo en decidir. Normalmente, la decisión se tomaría en minutos porque en esa época, la palabra de un hombre afroamericano no valía nada, efectivamente. Atticus espera poder apelar el veredicto, pero Tom, lamentablemente, intenta escapar de la prisión (según los guardias) y es matado a tiros en el intento. A Jem le cuesta aceptar el resultado del juicio y siente que su confianza en la bondad y racionalidad de la humanidad ha sido traicionada.
Mientras tanto, el señor Ewell amenaza a Atticus y a otras personas relacionadas con un juicio porque se siente humillado. Logra vengarse una noche cuando Jem y Scout vuelven caminando de la escuela a su casa una vez que ha concluida la obra de Noche de Brujas. Los sigue en la oscuridad, los intercepta e intenta matarlos con un gran cuchillo de cocina. Jem se quiebra el brazo, y Scout, que usaba un minúsculo disfraz de jamón que le impedía ver qué le esta pasando, no pudo evitar el ataque. El elusivo Boo Radley apuñala al señor Ewell y salva a los niños. Finalmente, Scout tiene la oportunidad de conocer al tímido y nervioso Boo. Al final de la noche, el sheriff declara que el señor Ewell cayó sobre su propio cuchillo así que Boo, el héroe de la situación, no será juzgado por asesinato. Scout acompaña a Boo a su casa e imagina cómo él ha visto al pueblo y observado a Jem, a Dill y a ella a través de los años desde el interior de su hogar. Boo entra, cierra la puerta, y ella jamás lo vuelve a ver.
